Recombinant Technologies (United States)

ABSTRACT In some cancers, patients responding to immune checkpoint inhibitors (ICI) usually harbor tumors with a higher tumor mutational burden and increased lymphocyte infiltration targeting mutation-derived neoantigens (neoAgs). In the NASIR-HCC trial, patients with hepatocellular carcinoma (HCC) received selective internal radiation therapy and the anti-PD-1 antibody Nivolumab, but many of them did not achieve clinical benefit (B). Since neoAg-based vaccination could enhance tumor infiltration and ICI responses, we studied neoAg-specific immunity in these patients and assessed whether patients with no benefit (NB) harbored sufficient immunogenic neoAgs for therapeutic vaccination. Using predicted neoAgs from 6 B and 4 NB patients, we tested immune reactivity in vitro. NeoAg-specific responses were detected in 75% of B and 83% of NB patients, recognizing 37% and 63% of neoAgs tested, respectively. In vivo immunization experiments in HLA transgenic HHD-DR1 mice using HLA-A*02.01- or HLA-DRB1*01-predicted neoAgs from four NB patients revealed responses against most neoAgs (87% and 73%, respectively), expanding the repertoire of immunogenic epitopes. Finally, polyepitopic peptide vaccination containing neoAgs from an NB patient induced stronger and broader T-cell responses compared to polyepitopic DNA vaccine. Our results demonstrate the immunogenicity of neoAgs in our cohort, supporting their potential utility in therapeutic vaccines designed to boost antitumor immunity.

A recombinant preparation of human granulocyte-colony stimulating factors (rh-GCSF), filgrastim and its advanced form pegfilgrastim i.e., pegylated form have widely been employed in the management of neutropenia caused by cancer chemotherapy. Their formulations from different manufacturers are commercially available in the market for patient use. Though regulatory guidelines worldwide have laid down methodology for ensuring quality control testing of such products before entering into the market, yet, the quality data of copy products are seldom available. In this 8year retrospective analysis carried out on seven products each of both the molecules, a comparison of quality parameters based on their safety and efficacy studies is presented to understand any variability. The utilization of orthogonal techniques was done for the filgrastim and pegfilgrastim products of different manufacturers to address the critical quality attributes for identity, purity, potency and bioactivity. The quality of the batches was analyzed based on compendial guidelines for filgrastim products and manufacturers' method of analysis for pegfilgrastim products. The products were evaluated for presence of endotoxin, aggregate impurities (monomer > 97%), related proteins (< 3.5%), and other impurities with different molecular masses (no separate band in SDS-PAGE) and were found within limits. The products were also assessed for their potency though cell-based proliferation assay (80-125%) and protein content (80-125%). They were found to be of standard quality with no substantial differences in quality parameters among batches of a product (intra-variability) and among all different products (intervariability).

Free energy perturbation (FEP) methods have become indispensable for predicting relative binding free energies (RBFE) in lead optimization, yet they often suffer from slow convergence due to high-energy barriers in ligand conformational sampling. In this work, we introduce and validate a terminal-flip Monte Carlo move specifically designed to accelerate conformational sampling in alchemical simulations. We integrated terminal-flip Monte Carlo into alchemical RBFE calculations of protein–ligand complexes and benchmarked it on MCL1, JNK1, and Factor Xa systems. Terminal-flip Monte Carlo yields a 2-5× faster convergence of key dihedral distributions and improves ∆∆G estimates by up to 1 kcal/mol compared with conventional MD-based FEP. Our method removes sampling biases in scaffold-hopping transformations and is straightforward to implement in existing FEP workflows.

Proteus species are frequently isolated from urinary tract infections (UTIs) and diabetic foot infections (DFIs). We aimed to evaluate the presence of virulence genes in P. mirabilis and P. vulgaris strains isolated from DFI and UTI. A total of 78 Proteus isolates (57 P. mirabilis and 21 P. vulgaris) collected from patients were studied. The isolates were identified using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometer. The presence of virulence-associated genes (hlyA, mrpA, atfA, pmfA, hmpA, ptaA, ureA, ureC, zapA, ireA, rsbA, flaA, and ucaA) was evaluated by polymerase chain reaction (PCR). 46 isolates were obtained from wound cultures, and 32 were obtained from the midstream urine cultures. All virulence genes, except hlyA, were detected in the study. ureA was the most detected gene in both UTI (100%) and DFI isolates (84.8%). The distributions of ureC, flaA, hpmA, ireA, rsbA, pmfA, zapA, ucaA, ptaA, atfA, and mrpA genes in DFI and UTI isolates were as follows: 82.6% and 96.9%, 71.7% and 93.8%, 69.6% and 93.8%, 69.6% and 96.9%, 69.6% and 96.9, 67.4% and 81.3%, 65.2% and 43.8%, 54.3 and 71.9%, 34.8% and 96.9%, 26.1 and 93.8%, and 23.9% and 46.9%, respectively. We demonstrated that P. mirabilis and P. vulgaris express a variety of virulence genes related to pathogenicity. All virulence genes were found to be more frequent in UTI isolates except zapA. There is limited data on the virulence factors of Proteus species in DFIs. Further studies are needed to investigate virulence genes in wound isolates.

The present study aimed to disclose the state of English writing proficiency among students and analyze how differentiated learning strategies in Kurikulum Merdeka Belajar approaches address the needs of different student populations when teaching writing English. This study used descriptive qualitative methods which employed observation, questionnaire and interview to collect the data. The participants of this study were one English subject teacher and 35 grade XK of students of MA. Muallimat NWDI Pancor in the academic year 2023-2024. The study's findings demonstrated that, while students' writing is currently in fairly good condition, it is far from perfect, as shown by the percentage data presented. The occasionally answer had the highest percentage data presentation, totaling 42.86%. There were 24 students who thought that they had difficulty to found an interesting idea to write about. Differentiated learning strategies can meet the needs of divers students in teaching writing English throuhg deviding students based on learning styles, namely visual, auditory and kinesthetic. It supports the quality of students' English writing learning, especially in finding interesting topics to write about because this learning provides suitability of materials, processes and tasks or projects according to the needs, abilities and creativity of students in the learning process.

INTRODUÇÃO: A tecnologia de proteínas recombinantes é aplicada em diversas áreas, e oferece produção consistente, alta pureza e personalização, com vantagens significativas sobre fontes naturais. OBJETIVO: Este estudo tem como objetivo avaliar o impacto da suplementação de sorbitol na produtividade da proteína activina A. MATERIAIS E MÉTODOS: Foi utilizada uma cepa recombinante de Komagataella phaffii para expressar a proteína activina A sob o controle do promotor AOX1. As células foram pré-cultivadas em meio YPD e transferidas para meio BSM. Durante a fase de indução, sorbitol (25; 50; 75 e 100 g/L) foi adicionado entre induções com metanol. A presença da activina A foi confirmada por meio de eletroforese em gel de poliacrilamida e coloração por prata. Além disso, a proteína foi quantificada utilizando o método de Bradford. RESULTADOS: Os resultados demonstraram que o sorbitol aumentou a expressão da proteína Activina A em até 44%. CONCLUSÃO: O sorbitol emerge como um candidato promissor para aprimorar a expressão de proteínas recombinantes em K. phaffii. Palavras-chave: Proteínas Recombinantes; Sorbitol; Activina A; Komagataella phaffii. A biotecnologia é crucial para avanços em medicina, terapia gênica e diagnósticos, com as proteínas recombinantes (PR) desempenhando papel central. A produção de PR pode ser feita em larga escala com qualidade e eficácia consistentes, além de facilitar a purificação, reduzindo impurezas e efeitos colaterais, quando comparados a purificações a partir de fontes

\n Vacinação contra doenças virais e bacterianas tem sido uma das histórias de sucesso da medicina humana e veterinária. Vacinas genéticas são constituídas apenas de DNA (como plasmídeos) ou RNA (como mRNA), que são entregues às células alvo. Esta abordagem proporciona uma vantagem significativa, pois essas preparações em geral apresentam facilidade de construção genética, baixo custo, rapidez de produção em massa, estabilidade elevada e um perfil de segurança atraente. Vacinas baseadas em RNA recentemente receberam maior atenção porque, ao contrário de vacinas de DNA, são processadas no citoplasma, excluindo a necessidade de entrada no núcleo celular. O vírus Semliki Forest (SFV, Alphavirus, Togaviridae ) possui um RNA genômico, auto replicativo, de simples fita e polaridade positiva, protegido em uma nucleocápside icosaédrica, composta pelo próprio RNA e pela proteína de cápside viral (C), de 267 aminoácidos. A nucleocápside contém 180 cópias da proteína C e é coberta por uma membrana lipoprotéica contendo as glicoproteínas virais. Para realizar a entrega de moléculas de RNA com fins de imunização é fundamental que o material esteja protegido da ação de enzimas. Assim, o objetivo deste trabalho foi expressar a proteína C recombinante de SFV em E.coli , associá-la in vitro com RNA auto replicativo, contendo gene repórter e fazer entrega deste complexo à célula alvo. Para isso, o gene da proteína C foi obtido de forma sintética e clonado em um vetor de expressão em bactérias, pET-28a(&amp;#43;). Para a expressão da proteína C recombinante foram utilizadas bactérias E. coli BL21(DE3) e testadas diferentes temperaturas após indução com IPTG. A proteína obtida foi purificada por cromatografia de afinidade e a amostra foi dialisada utilizando coluna de dessalinização. Após a purificação, a proteína recombinante foi submetida a uma associação in vitro com RNA, obtido através de transcrição in vitro . A eficiência de formação do complexo Proteína-RNA foi medida pela quantidade diferencial de RNA livre antes e após o procedimento por eletroforese em gel de agarose e pela análise através de imagens obtidas por microscopia eletrônica de transmissão. A entrega do complexo Proteína-RNA foi realizada de forma eficiente à célula alvo. Desta forma, de maneira geral, a proteína de capsídeo do vírus SFV é capaz de se associar in vitro com RNA auto replicativo, trazendo proteção e estabilidade ao mesmo, bem como realizar a entrega desse material à célula alvo, através da desmontagem da nucleocápside no interior da célula hospedeira.\n

Epidemiological studies have shown that magnesium intake/excretion is inversely correlated with blood pressure (BP), and artificial supplementation of magnesium was able to prevent hypertension. However, there has been no molecular genetic study showing the importance of magnesium homeostasis in BP regulation. We analyzed magnesium content and BP of mice lacking genes encoding cyclin M (CNNM) Mg transporter family proteins. Systemic heterozygotes and the kidney-specific homozygotes for Cnnm2-deficient alleles are both viable and show hypomagnesemia, indicating the important function of CNNM2 in maintaining magnesium homeostasis in the kidney. Endogenous CNNM2 localizes at the basolateral membrane of kidney distal convoluted tubule cells, which play important roles not only in magnesium reabsorption but also in BP control. The BP of these viable strains is significantly reduced; the SBP values by telemetric measurements are 121.7 ± 2.8 mmHg in wild-type, and 110.2 ± 2.7 and 109.7 ± 3.6 mmHg in systemic heterozygotes and kidney-specific homozygotes, respectively. Analyses of mice lacking CNNM Mg transporters clearly demonstrated abnormalities in BP values, confirming the importance of magnesium homeostasis in maintaining BP.

A hemofilia A uma doena ligada ao cromossomo X causada pela deficincia do fator VIII da coagulao sangunea (FVIII). O tratamento disponvel consiste na terapia de reposio da protena do fator VIII derivada do plasma (FVIIIdp) ou recombinante (FVIIIr). Atualmente, dos 7 produtos recombinantes disponveis no mercado, 6 so produzidos em linhagens celulares de roedores. A expresso dessa protena em sistemas celulares no-humanos pode gerar uma molcula com perfil de modificaes diferente do endgeno, podendo levar a reaes imunognicas e gerao de inibidores anti-FVIIIr. Em funo disso, novas estratgias de produo tm sido avaliadas, como a utilizao de clulas hospedeiras mais eficientes no que diz respeito ao potencial de expresso da protena de interesse. Dentre as linhagens de interesse, a linhagem heptica SK-HEP-1 tem se destacado por apresentar altos nveis de expresso do FVIIIr e potencial para o cultivo em suspenso em meios livres de soro fetal bovino (SFB). Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi avaliar a produo de FVIIIr na linhagem celular humana SK-Hep-1 comparando duas estratgias para o estabelecimento de processos de produo em condies livres de soro e em suspenso: Estratgia 1 -adaptao para tais condies da linhagem j modificada geneticamente e Estratgia 2 -modificao gnica para a expresso da protena j em clulas previamente adaptadas tais condies. Para a estratgia 1, foram geradas duas linhagens recombinantes produtoras de FVIIIr, SK-HEP-F8/Neo-E1 e SK-HEP-F8/GFP-E1 aderentes e em cultivos suplementados com SFB. Na caracterizao da cintica e produo do FVIIIr as linhagens apresentaram taxas especficas mxima de crescimento (max) de 0,064 e 0,0031h -1 produzindo 1,0 e 0,78UI/mL de FVIIIr, respectivamente. Diversos protocolos de adaptao foram empregados, entretanto, no foi possvel obter sucesso na adaptao das linhagens recombinantes para condies livres de soro e em suspenso. Para a estratgia 2, as clulas SK-HEP-1 selvagens adaptadas ao meio de cultura livre de SFB SFMII apresentaram um valor de max de 0,0186h -1 e Xmax de 1,9x10 6 cels/mL. Para as etapas de modificao gnica da linhagem selvagem foram utilizados os mesmos vetores lentivirais empregados para a gerao das clulas recombinantes aderentes, pLVmpsvFVIIIB-Neo e pLVCMVFVIIIB-GFP. Para o primeiro, no foi possvel gerar uma linhagem produtora do FVIIIr. Para o segundo, foi possvel obter duas linhagens produtoras do FVIIIr com 0.14 e 0.12IU/mL de atividade pelo ensaio cromognico. O presente trabalho mostrou que a linhagem humana Sk-Hep-1 apropriada para a produo de altos nveis de FVIIIr. No entanto, maiores esforos devem ser voltados ao desenvolvimento de meios de cultura livres de soro especficos para a linhagem para possibilitar a produo eficiente do FVIIIr em suspenso em meios livre de soro.

\n Atualmente, o Brasil encontra-se na privilegiada posição de maior produtor e exportador mundial de carne bovina, tornando a pecuária uma das atividades nacionais mais importantes e rentáveis. Este dado enfatiza a importância de pesquisa e desenvolvimento em reprodução bovina, especialmente em hormônios estimuladores da ovulação, tais como a gonadotrofina coriônica equina (eCG). Os produtos comerciais à base de eCG comercialmente disponíveis são purificados a partir do sangue de éguas gestantes, apresentando variabilidade de lote para lote e presença de contaminantes. Estes fatos, juntamente com a limitação do material de partida (sangue equino), enfatizam a necessidade de haver um sistema de expressão de eCG recombinante passível de ser explorado comercialmente. Neste quesito, as células de mamíferos se mostram um sistema robusto para tal finalidade, visto que são capazes de adicionar modificações pós-traducionais às cadeias polipeptídicas, tais como a glicosilação, o que é essencial para o correto dobramento, maturação e montagem das duas subunidades, além de interferir diretamente com a meia-vida, o reconhecimento do receptor, a solubilidade e a atividade biológica das proteínas. No entanto, mesmo entre os sistemas de expressão heteróloga em células de mamífero, encontra-se muita variabilidade nos padrões de glicosilação adicionado. No presente trabalho, foi realizado um estudo comparativo através da clonagem e expressão de uma forma fusionada de eCG (reCG&amp;#946;&amp;#945;) em duas linhagens celulares diferentes: (1) CHO-DG44, um dos sistemas de expressão mais utilizados pelas indústrias farmacêuticas, capaz de adicionar N-glicanos complexos; e (2) 293T, uma linhagem humana capaz de produzir glicoproteínas carreando oligossacarídeos complexos e sialilados. Os resultados de atividade biológica (in vitro e in vivo) apontam uma maior atividade de reCG produzido por células CHO-DG44. O perfil de N-glicosilação de reCG produzido pelas células CHOD-G44 assemelhou-se mais à eCG selvagem, quando comparado a reCG produzido por células 293T. Por fim, estudos clínicos foram realizados com reCG produzido em meio livre de soro fetal bovino e parcialmente purificado, onde atividade específica de reCG produzido por células CHO-DG44 mostrou-se similar ao produto comercial selvagem.\n